本文采用HPLC分析啤酒花浸膏中的葎草酮、合葎草酮、加葎草酮、蛇麻酮、合蛇麻酮和加蛇麻酮6種同系化合物，通過(guò)優(yōu)化色譜條件，在等度洗脫條件下實(shí)現(xiàn)了其中兩對(duì)難分離同分異構(gòu)體的基線(xiàn)分離;收集這6種組分并對(duì)其進(jìn)行了紫外(UV)光譜、紅外(IR)光譜和質(zhì)譜(MS)表征。
1實(shí)驗(yàn)部分
1．1儀器和藥品
P230II高壓恒流泵，UV230II紫外-可見(jiàn)波長(zhǎng)檢測(cè)器，ZW色譜柱恒溫箱;7725i手動(dòng)進(jìn)樣閥(美國(guó)Rheodyne公 司) ;Finnigan液 相 色 譜-質(zhì) 譜 聯(lián) 用 儀(美 國(guó)Thermo公司) ;TU-1810APC紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì);EQUINOX55型傅里葉變換紅外光譜儀(德國(guó)BRUKER公司)。
甲醇、乙腈、乙醇(色譜純) ;磷酸(分析純) ;實(shí)驗(yàn)用水由Milli-Q純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)制備;啤酒花浸膏。
1．2樣品制備
稱(chēng)取1.0056g浸膏于5mL離心管中，在30°C水浴中超聲振蕩，用30mL甲醇分多次將樣品轉(zhuǎn)移至50mL燒杯中，在水浴中超聲振蕩30min后轉(zhuǎn)移至100mL容 量 瓶 中，用 甲 醇 定 容，充 分 混 勻。取19.0mL上述溶液于50mL容量瓶中，用甲醇定容，混勻，用0.45μm油膜過(guò)濾，濾液供分析。樣品應(yīng)在避光、低溫條件下保存。
1．3分析條件
HPLC條件:HypersilODS2色譜柱(250mm×4.6mm，5μm) ，流動(dòng)相為乙腈-0.1%(v/v)磷酸水溶液(pH2.2) (65∶35，v/v) ，流速為1.0mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為315nm，進(jìn)樣量為20μL，柱溫為室溫。
UV光譜條件:樣品用乙腈溶解，掃描波長(zhǎng)范圍為199～499nm。IR光譜條件:將樣品與干燥的KBr粉末按1∶100的質(zhì)量比混合，在瑪瑙研缽中研磨壓片，掃描范圍為4500～500cm－1。
MS條件:電離方式為電噴霧電離(ESI) ，離子源溫度為150.00°C，檢測(cè)器電壓為3.05kV，質(zhì)量掃描范圍為m/z300.00～1000.00，一級(jí)全掃描質(zhì)譜分析。
2結(jié)果與討論
2．1色譜條件的優(yōu)化
2．1．1磷酸的影響
以甲醇-水(含0.26%磷酸或磷酸調(diào)節(jié)pH為2.5)為流動(dòng)相分析啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸為參考，考察了酸的加入對(duì)HPLC分離啤酒花浸膏中的α-酸和β-酸的影響。從圖2a中可以看出，不加酸時(shí)色譜峰展寬，且嚴(yán)重拖尾，分離度低;加入0.1%(v/v)磷酸后目標(biāo)物的出峰時(shí)間比不加酸時(shí)滯后了3～4min(見(jiàn)圖2b) ，其原因可能是不加酸時(shí)啤酒花浸膏樣品中的有效成分解離，以離子形式存在，在C18柱中保留相對(duì)較弱，導(dǎo)致出峰提前;加入酸使流動(dòng)相的酸度增加，抑制了目標(biāo)物在溶劑中的解離，使目標(biāo)物峰的峰形得到改善，柱效增加，樣品的分離度也明顯提高。
2．1．2有機(jī)溶劑的影響
考察了分別以甲醇、乙醇及乙腈作為流動(dòng)相中的有機(jī)相對(duì)啤酒花浸膏的HPLC分離效果。從圖3a可知，以甲醇作有機(jī)相時(shí)zui大保留時(shí)間大于350min，且組分2和3沒(méi)有達(dá)到基線(xiàn)分離;從圖3b可知，以乙醇作有機(jī)相時(shí)可分出4種組分，分別為合葎草酮(1)、葎草酮與加葎草酮合峰(2+3)、合蛇麻酮(4)、蛇麻酮與加蛇麻酮合峰(5+6) ，兩對(duì)同分異構(gòu)體都沒(méi)有得到很好的分離;從圖3c可知，乙腈的選擇性相對(duì)較好，用其作有機(jī)相時(shí)柱壓較小，且6種組分均得到了較好的分離，兩對(duì)同分異構(gòu)體的分離度(Rs)分別為1.58和1.55，均實(shí)現(xiàn)了基線(xiàn)分離，故選擇乙腈作流動(dòng)相的有機(jī)相。
2．1．3溫度的影響
在色譜分離中，色譜柱溫度的改變會(huì)影響樣品的分離度及保留時(shí)間，故有考察的必要。研究結(jié)果表明，溫度每上升5°C，分離時(shí)間縮短約5min(以組分5計(jì)) ，兩對(duì)同分異構(gòu)體的分離度變化如表1所示。
柱溫從室溫(25°C)上升到35°C時(shí)，組分2和3及5和6的分離度分別下降12.7%和18.7%，分離度均低于1.5，不能達(dá)到基線(xiàn)分離的要求［12］;溫度上升到45°C時(shí)，組分5和6的分離度下降了約30%。溫度的升高雖然使保留時(shí)間提前，但分離度相應(yīng)地降低，使兩對(duì)同分異構(gòu)體的分離效果變差，不能達(dá)到基線(xiàn)分離，故選擇柱溫為室溫。
2．2有效成分的制備與表征
2．2．1有效成分的制備
取1.2節(jié)中所制備的樣品在*分離條件下進(jìn)樣，按出峰時(shí)間收集6種組分(合葎草酮、葎草酮、加葎草酮、合蛇麻酮、蛇麻酮、加蛇麻酮) ，分別記為I、II、III、IV、V和VI。按1.3節(jié)所述的分析條件分別對(duì)收集的6個(gè)組分進(jìn)行HPLC分析，檢測(cè)其純度。通過(guò)面積歸一化法測(cè)得6種組分的純度分別為98.2%、94.3%、96.6%、93.2%、92.6%和90.2%。
2．2．2結(jié)構(gòu)表征
(1)UV光譜:組分I的UV光譜如圖4所示，其zui大紫外吸收波長(zhǎng)(λmax)為227nm;從其余5種組分的UV光譜(圖略)可見(jiàn)其λmax分別為222、222、323、321和323nm。在320nm左右有強(qiáng)的UV吸收帶說(shuō)明結(jié)構(gòu)式中有3個(gè)共軛雙鍵，且此處的吸收譜帶說(shuō)明還有外環(huán)羥基的作用。羥基是助色基團(tuán)，其與苯環(huán)連接，形成n-π共軛導(dǎo)致其zui大吸收波張紅移至220nm左右有zui大吸收波長(zhǎng);大于270nm處的譜帶是由于結(jié)構(gòu)式中的羰基的紫外吸收所致;在222nm、227nm處的吸收主要是由于六元環(huán)上的烯醇式-酮式互變作用引起。
(2)IR光譜:組分I的IR光譜見(jiàn)圖5(其余5種組分的IR光譜圖略)。該化合物在3412cm－1的吸收譜帶是羥基的伸縮振動(dòng)吸收峰;在2975～2840cm－1有3個(gè)強(qiáng)吸收譜帶，說(shuō)明分子內(nèi)有甲基、次甲基、亞 甲 基 的C－H對(duì)稱(chēng)與不對(duì)稱(chēng)伸展振動(dòng);1467cm－1的譜帶說(shuō)明分子中含有甲基或乙基;1378cm－1處的吸收譜帶證實(shí)有甲基存在;1525～1680cm－1處的一組譜帶是六元環(huán)共軛體系C=C和鄰 接C=O的 伸 縮 振 動(dòng) 吸 收 區(qū);1200～1000cm－1處的吸收帶表示六元環(huán)上的碳?xì)涿鎯?nèi)的彎曲振動(dòng)，說(shuō)明環(huán)上有鄰、間、對(duì)位取代基。該表征結(jié)果與其結(jié)構(gòu)吻合。
(3)LC-MS:組分I的質(zhì)譜圖見(jiàn)圖6，可以看出其準(zhǔn)分子離子峰為m/z348.96;其余5種組分的準(zhǔn)分子 離 子 峰 分 別 為m/z362.92、362.96、400.94、414.94、414.96，6種組分的分子式分別為C20H28O5、C21H30O5、C21H30O5、C25H36O4、C26H38O4、C26H38O4，MS表征結(jié)果與理論值一致。
通過(guò)UV光譜、IR光譜和MS對(duì)收集的6種組分進(jìn)行表征，結(jié)果與其結(jié)構(gòu)吻合，確認(rèn)所收集的組分I為合葎草酮，II為葎草酮，III為加葎草酮，IV為合蛇麻酮，V為蛇麻酮，VI為加蛇麻酮。
3結(jié)語(yǔ)
建立了HPLC同時(shí)測(cè)定啤酒花浸膏中6種活性組分的方法，在等度洗脫下實(shí)現(xiàn)了兩對(duì)難分離同分異構(gòu)體的基線(xiàn)分離。該法具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、分離度好等優(yōu)點(diǎn)，可用于啤酒花浸膏中酸性成分的分析。
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