材料與方法
實(shí)驗(yàn)試劑與儀器
黑曲霉屬脂肪酶(S-7449 from Aspergillus niger,三丁酸甘油酯; 考馬斯亮藍(lán)G-250; 奧利司他; 聚乙烯醇(簡稱PVA, 聚合度1750); 其他試劑為國產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水為雙蒸水。
超級恒溫水浴鍋;高速離心機(jī);精密PH計;超聲儀;安捷倫氣相色譜儀帶FID檢測。
色譜條件Supecl-NUKOLTMFFAP毛細(xì)管柱(固定相為對苯二甲酸改性的聚乙二醇；30 m × 0.53 mm × 0.5 μm)，柱溫100 °C，保持5 min，以20 °C·min−1的速率升溫至180 °C后，保持6 min。分流。進(jìn)樣口溫度250 °C，檢測器溫度250 °C，載氣（氮?dú)猓┝魉?0 mL·min−1，氫氣流速30 mL·min−1，空氣流速300 mL·min−1，尾吹30 mL·min−1。進(jìn)樣量1 μL。
溶液的配制
正丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取正丁酸適量，用乙腈稀釋，配制成8個不同濃度的正丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。
脂肪酶溶液：精密稱取適量酶粉，溶于pH 7.5的0.1 mol·L−1Tris-HCl緩沖液10 mL中，超聲20 min，離心10 min（3 500 r·min−1）。取上清液作為酶反應(yīng)液。脂肪酶蛋白濃度以考馬斯亮藍(lán)法測定。
三丁酸甘油酯乳化液：精密量取三丁酸甘油酯1 mL，以2%PVA溶液定容至10 mL，超聲20 min。
脂肪酶活力的檢測
測定原理：三丁酸甘油酯在脂肪酶的作用下水解成甘油和正丁酸。產(chǎn)物正丁酸可以通過氣相色譜進(jìn)行定量分析。由此，可以計算出脂肪酶的活力單位。
脂肪酶活性測定：反應(yīng)總體積為500 μL。空白組組成為：底物乳化液100 μL，pH 7.5的Tris-HCl緩沖液400 μL。實(shí)驗(yàn)組組成為：底物乳化液100 μL, pH 7.5的Tris-HCl緩沖液200 μL，酶液200 μL。在32 °C水浴反應(yīng)5 min后，加入乙腈800 μL終止反應(yīng), 振蕩10 s，離心10 min（10 000 r·min−1），取上清液進(jìn)樣分析。
脂肪酶活力單位定義：在pH為7.5，溫度為32 °C條件下，每分鐘催化三丁酸甘油酯水解生成1 μmol正丁酸的量，定義為一個酶活力單位。計算公式為：
X為脂肪酶活力(U·mg−1); B為實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生的正丁酸的量(μmol); A為空白組產(chǎn)生的正丁酸的量(μmol); C為體系中所含酶量(mg); t為反應(yīng)時間(min)。
脂肪酶抑制活性的檢測
原理：脂肪酶抑制劑（奧利司他）能抑制脂肪酶活性，通過比較有無抑制劑加入情況下生成的正丁酸量的差異，來評價脂肪酶抑制劑對脂肪酶活性的抑制程度。
測定方法：按上述方法，在反應(yīng)液中加入奧利司他甲醇溶液100 μL 后，測定生成的正丁酸的量。
結(jié)果與討論
1正丁酸標(biāo)準(zhǔn)曲線
正丁酸在0.11～11.35 mmol·L−1內(nèi)，峰面積(y) 與濃度(x) 的回歸方程為: y = 45 464x −3 115.2, r = 0.996 8。結(jié)果表明正丁酸的濃度與峰面積線性關(guān)系良好，因此可用氣相色譜外標(biāo)法對正丁酸進(jìn)行定量檢測。
2zui適pH值和反應(yīng)溫度的選擇
脂肪酶在堿性條件下具有較高的活力，*pH值為7.48。如圖所示。
不同來源的脂肪酶具有不同的zui適反應(yīng)溫度。通常，豬胰脂肪酶的zui適反應(yīng)溫度為37 °C左右；黑曲霉屬脂肪酶在25～35 °C具有較高的酶活，本文所測zui適反應(yīng)溫度為(31.6 ± 0.5) °C，如圖所示。
3反應(yīng)時間和方法專屬性
正丁酸在5 min左右就能被檢測到，且峰形良好, 如圖3所示。脂肪酶水解樣品中，正丁酸與其他雜質(zhì)能達(dá)到很好的分離效果。
4終止劑的選擇
每種終止劑平行測定3次，表中所列差值范圍為平行樣的標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍。結(jié)果下表。本文選用乙腈作為反應(yīng)終止劑。
在未經(jīng)反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)組溶液中分別加入濃度為0.22, 1.14和5.68 mmol·L−1的正丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液, 通過檢測并計算正丁酸的平均回收率來考察本方法的準(zhǔn)確性和精密性。平均回收率分別為90.3%, 104.6%和89.4%; RSD值分別為3.01%, 4.50%和6.64% (n = 3)。
6脂肪酶米氏常數(shù)的測定
該實(shí)驗(yàn)方法下米氏常數(shù)Km值為0.25 mmol·mL−1。結(jié)果如圖4所示。
7奧利司他溶劑的選擇及其IC50值的測定
為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可靠性，在反應(yīng)體系中加入奧利司他溶液，測定其對脂肪酶的抑制作用。奧利司他極性很小，通常只溶于氯fang、甲醇、二甲亞砜(DMSO) 和四氫呋喃(THF) 等有機(jī)溶劑。由于氯fang與緩沖溶液不互溶，DMSO對正丁酸峰產(chǎn)生干擾, 本文僅考察了甲醇和THF對酶的抑制情況。體系中16.7% (加入量100 μL) 的甲醇或THF對酶的抑制率分別為47.9%和89.4%。所以本文選擇抑制活性較小的甲醇作為奧利司他的溶劑。以甲醇空白液為對照(抑制率為0)，計算出IC50值為0.048 5 mg·mL−1，
結(jié)論
以氣相色譜檢測脂肪酶活力的方法克服了滴定法重現(xiàn)性差和準(zhǔn)確性低的缺點(diǎn)，具有反應(yīng)體積小，反應(yīng)時間短，檢測速度快等優(yōu)點(diǎn)，適合于脂肪酶活力的測定及其抑制劑的篩選。
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